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過氧化氫酶試驗 —— 原理、用途、操作步驟及注意事項

發(fā)布時間：

2025-07-07

過氧化氫酶試驗是一種生化檢測方法，用于判斷生物體是否產(chǎn)生過氧化氫酶。過氧化氫酶的作用是中和過氧化氫（H?O?）的殺菌效應(yīng)。它能加速H?O?分解為水和氧氣，該反應(yīng)可通過快速產(chǎn)生氣泡來觀察。
?? 過氧化氫酶試驗的歷史
基于酶的檢測方法在細(xì)菌鑒定中起著關(guān)鍵作用。1893 年，戈特斯坦（Gottstein）的一篇論文首次關(guān)注到細(xì)菌過氧化氫酶，使其成為最早被描述的細(xì)菌酶之一。
約 30 年后，麥克勞德（McLeod）和戈登（Gordon）開發(fā)并發(fā)表了被認(rèn)為是首個基于過氧化氫酶產(chǎn)生及反應(yīng)的細(xì)菌分類體系。
早期檢測過氧化氫酶的方法繁瑣、勞動強(qiáng)度大、耗時，且需要專用設(shè)備。多年來，加尼翁（Gagnon）等人最初描述的技術(shù)，尤其是托馬斯（Thomas）的方法已被改良和優(yōu)化，從而極大地簡化了該檢測的操作。
?? 過氧化氫酶試驗的用途
? 檢測細(xì)菌是否產(chǎn)生過氧化氫酶
? 區(qū)分過氧化氫酶陰性的鏈球菌、腸球菌與陽性的葡萄球菌、微球菌
? 區(qū)分耐氧的梭菌屬（陰性）與芽孢桿菌屬（陽性）
? 可輔助鑒定部分腸桿菌科細(xì)菌
? 用于細(xì)菌屬間鑒別，對某些革蘭陽性菌（如氣球菌屬）的種水平鑒定有價值（尿氣球菌Aerococcus urinae，陽性、綠色氣球菌Aerococcus viridians，陰性）
?? 過氧化氫酶試驗的原理
細(xì)菌有氧代謝產(chǎn)生H?O?，其積累會破壞細(xì)胞成分，達(dá)致死濃度時導(dǎo)致細(xì)菌死亡。含細(xì)胞色素系統(tǒng)的需氧菌和兼性厭氧菌普遍含有過氧化氫酶，該酶為四聚體，由四條約500個氨基酸的多肽鏈組成，每條鏈攜帶一個含鐵血卟啉基團(tuán)，可高效結(jié)合 H?O?。其催化效率極高，單個分子每秒可分解數(shù)百萬個 H?O?分子為水和氧氣，從而消除毒性保護(hù)細(xì)菌自身免受其致死效應(yīng)的影響。
嚴(yán)格厭氧菌因缺乏超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶，無法清除有氧環(huán)境中的超氧陰離子（O??）和 H?O?，活性氧毒性濃度引發(fā)氧化應(yīng)激級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞代謝崩潰死亡，這一機(jī)制清晰解釋了氧氣對嚴(yán)格厭氧菌的致死效應(yīng)。
過氧化氫酶檢測方法：將少量待測菌接種于 H?O?溶液，有酶時迅速產(chǎn)生氧氣氣泡，無或微弱氣泡則表明酶缺乏。需使用 24 小時內(nèi)新鮮培養(yǎng)物，需氧菌用 3% H?O?，厭氧菌用 15% H?O?。

?? 過氧化氫酶試驗的操作步驟
1. 試管法
?? 向試管中倒入 1 - 2ml 的H?O?溶液。
?? 用接菌環(huán)挑取 18 - 24 h的待測菌落，將其浸入過氧化氫溶液中。
?? 在深色背景下觀察是否立即產(chǎn)生氣泡。
2. 玻片法
?? 用接種環(huán)挑或涂布棒取少量待測菌落，將其轉(zhuǎn)移至干凈、干燥的載玻片表面。
?? 在載玻片上滴加一滴 3% 的過氧化氫溶液，勿混合。
?? 在深色背景下立即觀察是否有氧氣氣泡產(chǎn)生。
3. 試管（斜面）法
?? 向營養(yǎng)瓊脂斜面上生長的 18~24 h大量純培養(yǎng)物直接滴加 1.0 ml 3% 過氧化氫溶液
?? 將試管置于深色背景前，觀察是否立即產(chǎn)生氣泡
?? 過氧化氫酶試驗的結(jié)果判讀及示例
1. 陽性結(jié)果：產(chǎn)生大量氣泡，有明顯的氣泡活動。
?? 示例：葡萄球菌、微球菌、李斯特菌、白喉棒狀桿菌、洋蔥伯克霍爾德菌、諾卡菌、腸桿菌科（檸檬酸桿菌、大腸桿菌、腸桿菌、克雷伯菌、志賀菌、耶爾森菌、變形桿菌、沙門氏菌、沙雷菌）、假單胞菌、結(jié)核分枝桿菌、曲霉菌、隱球菌和馬紅球菌。
2. 陰性結(jié)果：沒有氣泡產(chǎn)生或僅有極少量氣泡產(chǎn)生。
?? 示例：鏈球菌和腸球菌。
過氧化氫酶試驗的質(zhì)量控制
? 陽性對照：金黃色葡萄球菌
? 陰性對照：糞腸球菌
?? 過氧化氫酶試驗的注意事項
1. 切勿從血瓊脂培養(yǎng)基中取待測菌。因為紅細(xì)胞中含有過氧化氫酶，若存在紅細(xì)胞，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。
2. 應(yīng)使用 18h ~24 h的培養(yǎng)物進(jìn)行試驗，老化菌會因酶活性喪失出現(xiàn)假陰性。
3. 過氧化氫酶活性與需氧代謝相關(guān)，厭氧菌培養(yǎng)后需暴露于空氣中至少 30 分鐘再檢測，否則易假陰性
4. 厭氧菌加試劑后，陽性反應(yīng)可能延遲至 1 分鐘。
5. 有些細(xì)菌會產(chǎn)生過氧化物酶，該酶也能催化H?O?分解，導(dǎo)致反應(yīng)呈弱陽性（緩慢產(chǎn)生少量氣泡）。應(yīng)將這種情況與真正的陽性反應(yīng)區(qū)分開來。
6. 部分金黃色葡萄球菌菌株用滴加法可能呈陰性，需用試管法重復(fù)試驗。
7. 顛倒試劑與菌落的添加順序可能導(dǎo)致假陰性。
8. 使用鐵絲和鉑接種環(huán)，如果接觸到H?O?，會導(dǎo)致假陽性結(jié)果。鎳鉻絲接種環(huán)則無此問題。
9. H?O?溶液必須新鮮配制，因為它非常不穩(wěn)定。
10. 同一實驗中若斜面有其他用途，可在使用后添加過氧化氫以節(jié)省材料。
11. 始終采用嚴(yán)格的無菌技術(shù)，盡可能在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行試驗。
12. 玻片法時將載玻片置于培養(yǎng)皿內(nèi)，保留培養(yǎng)皿蓋備用。滴加3%過氧化氫溶液后立即蓋上培養(yǎng)皿蓋以減少已證實可攜帶活細(xì)菌細(xì)胞的過氧化氫酶氣溶膠。
13. 30% H?O?有強(qiáng)腐蝕性，避免接觸皮膚，若不慎接觸，用大量流動清水沖洗。
?? 在 GB 4789中的應(yīng)用
標(biāo)準(zhǔn)   過氧化氫酶試驗結(jié)果
GB 4789.9-2014      空腸彎曲菌陽性（+）
  結(jié)腸彎曲菌陽性（+）
  海鷗彎曲菌陽性（+）
  烏普薩拉彎曲菌陰性（-）或微弱
GB 4789.11-2014      β-溶血性鏈球菌陰性（-）
GB 4789.14-2014      蠟樣芽孢桿菌陽性（+）
  蘇云金芽胞桿菌陽性（+）
  蕈狀芽胞桿菌陽性（+）
  巨大芽孢桿菌陽性（+）
GB 4789.30-2025      單核細(xì)胞增生李斯特氏菌陽性（+）